生物顯微鏡與光學(xué)濾光片 （此文章為轉載）

（圖源網(wǎng)絡(luò )，侵刪）

一、暗視野顯微鏡

(一) 原理和結構特點(diǎn) 

在日常生活中，室內飛揚的微?；覊m是不易被看見(jiàn)的，但在暗的房間中若有一束光線(xiàn)從門(mén)縫斜射進(jìn)來(lái)，灰塵便粒?？梢?jiàn)了，這是光學(xué)上的丁達爾現象。暗視野顯微鏡就是利用此原理設計的。它的結構特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器，常用的是拋物面聚光器，使光源的中央光束被阻擋．不能由下而上地通過(guò)標本進(jìn)入物鏡。從而使光線(xiàn)改變途徑，傾斜地照射在觀(guān)察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線(xiàn)投入物鏡內，因而整個(gè)視野是黑暗的。

在暗視野中所觀(guān)察到的是被檢物體的衍射光圖像．并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運動(dòng)，不能辨清物體的細微結構。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于1／2波長(cháng)，則各級衍射光線(xiàn)同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀(guān)察物體的構造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細微結構，但卻可分辨0.004um以上的微粒的存在和運動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2um)所不具有的特性，可用以觀(guān)察活細胞的結構和細胞內微粒的運動(dòng)等。 

(二) 制作中央遮光板 
普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無(wú)暗視野聚光器時(shí)，可用厚黑紙片制作一個(gè)中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。

1．將顯微鏡聚光器調到最高位置，用低倍鏡對好焦距。 

2．取下目鏡，從鏡筒中觀(guān)察并調節光闌的大小，使其與鏡筒中所見(jiàn)物鏡的視野相等。 

3．用厚黑紙剪制中央擋光板。外圈直徑與濾光片框架相同，中央部分的大小與調節好的光闌孔徑一樣(可用半透明的小紙片，放在通光孔處聚光鏡鏡面上，紙上顯示的光斑即為光闌的孔徑，再用圓規量取大小)。 

4．將中央擋光板放在濾光片框架上，開(kāi)大光闌進(jìn)行樣品觀(guān)察。 

如需使用高倍鏡作暗視野觀(guān)察，應按高倍鏡對焦后的視野大小重新制作中央擋光板。 

保存好各自制作的中央遮光板，以便在后面的實(shí)驗中使用。 

（三）使用方法 

1．把暗視野聚光器裝在顯微鏡的聚光器支架上。 

2．選用強的光源，但又要防止直射光線(xiàn)進(jìn)入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。 

3．在聚光器和標本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線(xiàn)于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。 

4．升降集光器，將集光鏡的焦點(diǎn)對準被檢物體，即以圓錐光束的頂點(diǎn)照射被檢物。如果聚光器能水平移動(dòng)并附有中心調節裝置，則應首先進(jìn)行中心調節，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線(xiàn)上。 

5．選用與聚光器相應的物鏡，調節焦距 操作方法與普通顯微鏡相同，找到所需觀(guān)察的物像。 

（四）觀(guān)察 觀(guān)察示教臺上暗視野顯微鏡下的活細胞。在黑暗的背景里，可見(jiàn)細胞、細胞核和細胞器的衍射光圖像。 

二、相差顯微鏡 

(一) 原理和結構特點(diǎn) 

光波有振幅（亮度）、波長(cháng)（顏色）及相位(指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達到的位置)的不同。當光通過(guò)物體時(shí)，如波長(cháng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀(guān)察到，這就是普通顯微鏡下能夠觀(guān)察到染色標本的道理。而活細胞和未經(jīng)染色的生物標本，因細胞各部微細結構的折射率和厚度略有不同，光波通過(guò)時(shí)，波長(cháng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化(相應發(fā)生的差異即相差)，而這種微小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀(guān)察到。相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現象，把相差變成振幅差(明暗差)，同時(shí)它還吸收部分直射光線(xiàn)，以增大其明暗的反差。因此可用以觀(guān)察活細胞或未染色標本。 

相差顯微鏡(圖2-3)與普通顯微鏡的主要不同之處是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌，用帶相板的物鏡(通常標有PH的標記)代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠鏡。環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來(lái)。相板安裝在物鏡的后焦面處，相板裝有吸收光線(xiàn)的吸收膜和推遲相位的相位膜。它除能推遲直射光線(xiàn)或衍射光的相位以外，還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。調軸望遠鏡是用來(lái)進(jìn)行合鈾調節的。相差顯微鏡在使用時(shí)，聚光鏡下面環(huán)f狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線(xiàn)上，必需調節光闌的亮環(huán)和相板的環(huán)狀圈重合對齊，才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂，應被吸收的光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。 

(二)使用方法 相差裝置為多功能系列顯微鏡中的附屬裝置．與普通顯微鏡配合使用。

1．相差裝置的調換安裝 卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可吸收紅色和藍色光，使波長(cháng)范圍小的單色光線(xiàn)進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀(guān)察獲得良好的效果。再從轉換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 

2．調焦 打開(kāi)光源，旋轉集光器轉盤(pán)，將“o”對準標示孔，使普通聚光器部分進(jìn)入光路。先使用低倍相差物鏡，按普通顯微鏡操作方法進(jìn)行對光和調焦。 旋轉環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應，如相差物鏡為40 x時(shí)應用x40標示孔的光闌。 

3．合鈾調整 拔出目鏡，插入合鈾望遠鏡，一邊從望遠鏡內內觀(guān)察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉動(dòng)望遠鏡內筒使其下降，當對準焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，此時(shí)可將望遠鏡固定住。再升降集光器并調節其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后左右前后調節環(huán)狀光闌聚光器上的調節鈕，使兩環(huán)完全重合＜圖2—4，如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內側時(shí)，應降低集光器使亮環(huán)放大；反之，則應升高聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可能是載玻片過(guò)厚之故，應更換。合抽調整完畢，抽出望遠鏡，換回目鏡，按常規要領(lǐng)進(jìn)行觀(guān)察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調整。使用油鏡時(shí)，集光器上透鏡表面與載玻片之間要同時(shí)加上香伯泊。 

(三)觀(guān)察 在相差顯微鏡下觀(guān)察活細胞，可清楚地分辨細胞的形態(tài)，細胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒狀結構。

三、熒光顯微鏡 

(一)原理和結構特點(diǎn) 

熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統發(fā)出一定波長(cháng)的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀(guān)察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學(xué)成分等的研究。 熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源一般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長(cháng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長(cháng)，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長(cháng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內發(fā)射出較照射波長(cháng)更長(cháng)的可見(jiàn)熒光。熒光具有專(zhuān)一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀(guān)察到專(zhuān)一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛?二是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現出專(zhuān)一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標本材料來(lái)激發(fā)熒光的(圖2—5)。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強，而缺點(diǎn)是隨放大倍數增加其熒光減弱．所以對觀(guān)察較大的標本材料較好。

2．落射式熒光顯微鏡 這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2-6)。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿(mǎn)足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

（二）使用方法．

1．打開(kāi)燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮點(diǎn)。 

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。 

3．用低倍鏡觀(guān)察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。 

4．放置標本片，調焦后即可觀(guān)察。 使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀(guān)察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須用無(wú)熒光

特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì )不穩定，影響汞燈壽命。

(三)觀(guān)察 在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，可見(jiàn)經(jīng)o．01％的丫啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。